Procedimento geral para a manutenção (passagem) de linhagens de células aderentes –e.g., NIH 3T3 (RRID:CVCL_0594) ou HEK293 (RRID:CVCL_0045)) em cultivo *in vitro*, empregando tripsina-EDTA para a dissociação da monocamada celular.

A maioria das células derivadas de tecidos sólidos cresce *in vitro* como uma monocamada aderida à superfície de frascos plásticos tratados. Quando as células atingem um grau de confluência ideal (geralmente 70-80%), o espaço e os nutrientes tornam-se limitantes, exigindo o subcultivo (passagem). O método mais comum para o dissociação celular é a digestão enzimática com tripsina, uma protease que cliva as proteínas de adesão celular. O EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) é frequentemente associado à tripsina para atuar como um quelante de íons de cálcio (Ca^2+) e magnésio (Mg^2+), que são essenciais para o funcionamento das integrinas e caderinas responsáveis pela adesão intercelular e matriz-substrato. Uma vez que as células estão em suspensão, a ação da tripsina deve ser rapidamente neutralizada pela adição de meio contendo soro (que possui inibidores naturais de tripsina, como a alfa-1-antitripsina) para evitar danos prolongados às membranas celulares e consequente morte celular.

Locais de execução do procedimento no IBTEC, UNESP:

• Laboratório de Cultura Celular (Setor L): Para a avaliação da confluência, manipulação asséptica, lavagem, tripsinização e replaqueamento das células (semeadura).

Todos localizados no Laboratório de Cultura Celular (Setor L) do IBTEC:

• Cabine de segurança biológica
• Microscópio óptico invertido
• Banho-maria a 37°C
• Centrífuga clínica para tubos de 15mL e 50mL
• Estufa de cultura celular umidificada, com 5% de CO₂ a 37°C
• Pipetador motorizado

1. Assegure-se de que a cabine de segurança biológica esteja limpa e preparada para uso (assepsia com etanol 70%).
2. Avalie a confluência da cultura no microscópio invertido. ℹ️ OBSERVAÇÃO: Recomenda-se subcultivar ao alcançar 70-80% de confluência. Não permita que as culturas alcancem 100%!
3. Pré-aqueça o meio de cultura completo, a solução de Tripsina-EDTA e o DPBS a 🌡️ 37°C em banho-maria por ⏳ 15-20 min.
4. Na cabine, remova o meio de cultura antigo do frasco com cuidado para não danificar a monocamada de células aderentes e descarte-o.
5. Lave suavemente a monocamada adicionando DPBS (sem Ca^2+ e Mg^2+) pela parede do frasco oposta às células. Agite suavemente e descarte a lavagem. ℹ️ OBSERVAÇÃO: Esta etapa remove inibidores de tripsina presentes no soro residual. (Use ~5mL para T-25 ou ~10mL para T-75).
6. Adicione a solução de Tripsina-EDTA em volume suficiente para cobrir totalmente a monocamada celular (ex: 1-2 mL para T-25; 2-3 mL para T-75).
7. Agite o frasco gentilmente para a solução alcançar toda a superfície e retorne-o imediatamente para a estufa.
8. Incube o frasco na estufa a 🌡️ 37°C por ⏳ 2-5 min.
9. Observe ao microscópio. Se as células estiverem arredondadas e soltando-se, bata firme, porém suavemente, na lateral do frasco para deslocar completamente as células para a solução.
10. Imediatamente adicione um volume (no mínimo igual, preferencialmente o dobro) de meio de cultura contendo SFB para neutralizar e inibir a ação da tripsina.
11. Homogeneize a suspensão celular delicadamente utilizando uma pipeta sorológica, lavando o fundo do frasco repetidas vezes para quebrar os agregados celulares (“grumos”).
12. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico (Falcon) de 15mL ou 50mL.
13. Reserve uma pequena alíquota (ex: 10-20mcL) para quantificação da viabilidade celular utilizando azul-tripan em hemocitômetro.
14. Centrifugue a suspensão de células a 100-400×g por ⏳ 5 min (ou alternativamente, 100×g por 10 min) em temperatura ambiente.
15. Retorne o tubo para a cabine e remova o sobrenadante cuidadosamente.
16. ℹ️ Recomendável: Para remover completamente a tripsina residual, ressuspenda as células em DPBS, repita a centrifugação (100-400×g por ⏳ 5 min) e remova o sobrenadante novamente.
17. Ressuspenda delicadamente o pellet no volume apropriado de meio de cultura novo para plaqueamento.
18. Transfira o volume correspondente à densidade desejada (e.g., 1:2 a 1:6 ou 2-5×10⁴ células/cm² para NIH-3T3) para os novos frascos previamente rotulados.
19. Complete com meio de cultura até o volume final de trabalho do frasco e incube as células na estufa umidificada a 🌡️ 37°C com 5% de CO₂.

• ☣️ Risco Biológico: Manipule as linhagens celulares seguindo rigorosamente as normas de biossegurança de Nível 2 (NB-2). Todo o manuseio de frascos e manipulação de suspensões deve ocorrer obrigatoriamente dentro da cabine de segurança biológica para prevenir a contaminação da cultura e proteger o operador.
• 🧪 Risco Químico: A solução de Tripsina-EDTA pode causar irritação na pele, nos olhos e no trato respiratório em caso de contato ou inalação de aerossóis. O uso de luvas de látex ou nitrilo, jaleco e óculos de proteção é mandatório.
• 🚮 Descartes: Meios de cultura antigos contendo soro, soluções de lavagem e reagentes biológicos devem ser inativados quimicamente (ex: hipoclorito de sódio) antes de descartados em pia sob água corrente. Dependendo do tipo celular e patógenos associados, os líquidos podem demandar esterilização por autoclavagem antes de descarte sob água corrente (e.g., células infectadas com HIV). Materiais plásticos descartáveis devem ir para sacos brancos leitosos para incineração. 🚨 ATENÇÃO: para acondicionar adequadamente os materiais perfurocortantes, incluindo pipetas descartáveis (descarte em recipientes rígidos).

1. O tempo de incubação na tripsina varia significativamente entre diferentes linhagens celulares. Células fortemente aderentes (e.g., epiteliais) podem requerer concentrações maiores de tripsina (ex: 0,25%) ou maior tempo de exposição, enquanto linhagens mais frouxas (e.g., fibroblastos embrionários) podem se soltar em menos de 2 minutos. Monitore ativamente a tripsinização para evitar ação enzimática prolongada, o que compromete o fenótipo e a viabilidade celular.

© ViriCan | Grupo de Estudos em Carcinogênese Viral e Biologia dos Cânceres, UNESP. Botucatu, São Paulo, Brasil. info@virican.net