Descongelamento de linhagens celulares ou culturas primárias criopreservadas em nitrogênio líquido para o restabelecimento e início de cultura celular in vitro.

O processo de descongelamento de células criopreservadas é uma etapa crítica para garantir alta viabilidade celular e rápida recuperação da cultura. Durante a criopreservação, utilizam-se agentes crioprotetores, como o DMSO (dimetilsulfóxido) ou glicerol, que previnem a formação de cristais de gelo intracelulares que romperiam as membranas. No entanto, o DMSO torna-se rapidamente tóxico para as células em temperaturas acima de 4°C. Por este motivo, o protocolo exige que o descongelamento seja o mais rápido possível (imersão parcial em banho-maria a 37°C), seguido pela imediata diluição do crioprotetor em meio de cultura pré-aquecido. A adição do meio deve ser feita gota-a-gota para evitar um choque osmótico abrupto, que também pode levar à lise celular. Posteriormente, o crioprotetor residual é removido por meio de umacentrifugação branda, permitindo que as células sejam plaqueadas em condições ideais para retomada de sua proliferação.

Locais de execução do procedimento no IBTEC, UNESP:

• Câmaras Frias (Setor K): Para a localização e retirada do criotubo contendo as células de interesse no tanque de nitrogênio.
• Laboratório de Cultura Celular (Setor L): Para o descongelamento, manuseio asséptico na cabine e início do cultivo celular.

Todos localizados no Laboratório de Cultura Celular do IBTEC

• Banho-maria a 37°C
• Cabine de Segurança Biológica
• Centrífuga clínica para tubos de 15mL e 50mL
• Estufa de cultura celular umidificada, com 5% de CO₂ a 37°C
• Microscópio óptico invertido
• Pipetador motorizado

Legenda: | ⚠️ Atenção | ℹ️ Informação | ⏸️ Pausa | ⏳Tempo | 🌡️ Temperatura |

1. Assegure-se de que a cabine de segurança biológica esteja limpa e preparada para uso (assepsia com etanol 70%).
2. Pré-aqueça o meio de cultura completo a 🌡️37°C no banho-maria por pelo menos ⏳ 15-20 minutos.
3. Retire rapidamente o vial (criotubo) com as células do tanque de nitrogênio líquido e transporte-o em gelo seco ou caixa isotérmica até a Sala de Cultura Celular.
4. Incube o vial com as células congeladas no banho-maria a 🌡️ 37°C, imergindo apenas a porção inferior (não deixe a água tocar na tampa para evitar contaminação). Agite/inverta o tubo suavemente para auxiliar no descongelamento homogêneo.
5. ⚠️ IMPORTANTE: O processo deve levar em torno de ⏳ 1-2 min. Remova imediatamente o tubo do banho-maria assim que restar apenas um minúsculo cristal de gelo no interior. Dê seguimento ao procedimento tão logo as células estejam descongeladas.
6. Limpe rigorosamente a parte externa do criotubo com papel absorvente embebido em etanol 70% antes de inseri-lo na cabine de segurança biológica.
7. Transfira gentilmente a suspensão de células descongeladas do criotubo para um tubo cônico de 50mL. ⚠️ IMPORTANTE: Não usar criotubo de 15mL, pois o mesmo não permite agitação adequada durante a adição de novo meio às células.
8. Adicione o meio pré-aquecido gota-a-gota, lentamente, completando o volume até 10mL. ⚠️ IMPORTANTE: A adição lenta é fundamental para evitar estresse osmótico e lise celular induzida pela rápida mudança na concentração do DMSO.
9. ⚠️ IMPORTANTE: Agite gentilmente o tubo cônico de 50mL rotacionando-o com os dedos continuamente durante a adição do meio.
10. Retire uma pequena alíquota (ex: 10 a 20mcL) e misture com azul-tripan para quantificar o número de células viáveis em hemocitômetro.
11. Centrifugue a suspensão de células a 100–400×g por ⏳ 5 min em temperatura ambiente. ⚠️ IMPORTANTE: Esta etapa é estritamente necessária para remover o DMSO residual, que é tóxico e pode comprometer a viabilidade das células nos primeiros dias de cultivo.
12. Retorne o tubo para a cabine e remova o sobrenadante com cuidado para não perturbar o pellet de células no fundo do tubo.
13. Ressuspenda delicadamente o pellet em novo meio de cultura pré-aquecido, na quantidade calculada para se obter a densidade apropriada para o plaqueamento no frasco de cultura (no caso de células aderentes) ou crescimento em suspensão.
14. ℹ️ OBSERVAÇÃO: Para células muito sensíveis ou com baixa viabilidade inicial após descongelamento, pode-se iniciar a cultura com uma concentração maior de soro (ex: 20% SFB) e reduzir à concentração habitual de expansão (e.g., 10%) quando a cultura estiver aderida e estabilizada (⏳ 48h, pelo menos).
15. Transfira a suspensão para o frasco de cultivo previamente rotulado (Nome da linhagem, Passagem, Data, Responsável).
16. Incube as células a 🌡️ 37°C na estufa umidificada com 5% de CO2.
17. Inspecione a cultura ao microscópio invertido após ⏳ 24h para verificar a adesão celular, morfologia e ausência de contaminação.

• ❄️ Riscos físicos e térmicos: O manuseio de nitrogênio líquido e de criotubos recém-retirados exige o uso obrigatório de EPIs específicos: luvas criogênicas, óculos de proteção ampla ou protetor facial (_face shield_) e jaleco de algodão fechado. Há risco severo de queimaduras por frio e risco de explosão do criotubo devido à rápida expansão do nitrogênio líquido que possa ter infiltrado no tubo.
• ☣️ Risco Biológico: Manipule as células seguindo as normas de biossegurança de Nível 2 (NB-2). Todo o manuseio de frascos abertos deve ocorrer obrigatoriamente dentro da cabine de segurança biológica.
• 🚮 Descarte biológico: Materiais plásticos descartáveis que entraram em contato com as células devem ser descartados em sacos brancos leitosos para esterilização em autoclave pré-segregação para incineração. Os sobrenadantes contendo DMSO e meios de cultura devem ser inativados com hipoclorito de sódio antes do descarte na pia, sob água corrente.

1. Certifique-se de registrar a retirada do vial no inventário de células criopreservadas do ViriCan.
2. O choque térmico reverso prolongado (células descongeladas no DMSO deixadas em temperatura ambiente antes da diluição com meio) ocasiona morte celular massiva. Trabalhe com agilidade na etapa de transferência.

© ViriCan | Grupo de Estudos em Carcinogênese Viral e Biologia dos Cânceres, UNESP. Botucatu, São Paulo, Brasil. info@virican.net