Criopreservação de linhagens celulares e culturas primárias para armazenamento a longo prazo em nitrogênio líquido, visando a manutenção da viabilidade celular e preservação de características genotípicas e fenotípicas.

O congelamento de células requer um resfriamento lento e controlado, tipicamente a uma taxa de -1°C por minuto, para minimizar a formação de cristais de gelo intracelulares que causariam o rompimento da membrana plasmática. Para atingir essa taxa, em nosso grupo utilizamos um recipiente de congelamento próprio (Nalgene® Mr. Frosty) contendo isopropanol. Além disso, a adição de um agente crioprotetor, como o DMSO (dimetilsulfóxido), ao meio de congelamento diminui o ponto de congelamento e protege as células dos danos induzidos pelos cristais de gelo. O uso de alta concentração de soro (90%) maximiza a viabilidade pós-descongelamento, fornecendo um ambiente rico em fatores de proteção e nutrientes.

Locais de execução do procedimento no IBTEC, UNESP:

• Laboratório de Cultura Celular (Setor L): Para a quantificação celular, preparo do meio de congelamento e manuseio asséptico.
• Câmaras Frias (Setor K): Para o armazenamento inicial em freezer -80°C e posterior transferência para o tanque de nitrogênio líquido.

Localizados no Laboratório de Cultura Celular (Setor L), câmaras frias (Setor V), sala de amostras (Setor K) ou Lab. Central (Setor J) do IBTEC

• Cabine de segurança biológica (Setor L)
• Centrífuga clínica para tubos de 15mL e 50mL (Setor L)
• Microscópio óptico invertido (Setor L)
• Pipetador motorizado (Setor L, cabine de segurança biológica)
• Freezer ULT (-80°C) (Setor K)
• Tanque de armazenamento de nitrogênio líquido (Setor V)

1. Assegure-se de que a cabine de segurança biológica esteja limpa e preparada para uso (assepsia com etanol 70%).
2. Prepare o meio de congelamento misturando 90% de SFB e 10% de DMSO. ℹ️ OBSERVAÇÃO: A mistura do DMSO com soro/meio gera uma reação exotérmica. Recomenda-se preparar a solução com antecedência e mantê-la refrigerada a 🌡️ 4°C até o uso.
3. Obtenha a suspensão celular a partir da cultura (após a tripsinização para células aderentes ou diretamente para células em suspensão).
4. Retire uma pequena alíquota e misture com azul-tripan para quantificar o número de células viáveis em hemocitômetro. ⚠️ IMPORTANTE: Para linhagens celulares habituais, congelar apenas culturas saudáveis, em fase log de crescimento e com viabilidade > 80%.
5. Centrifugue a suspensão de células a 100–400×g por ⏳ 5 min em temperatura ambiente para formação do pellet.
6. Remova e descarte o sobrenadante com cuidado.
7. Adicione gentilmente a solução de congelamento (SFB + DMSO) previamente preparada ao tubo cônico contendo o pellet de células, dispensando o líquido preferencialmente escorrendo pela parede do tubo.
8. Ressuspenda o pellet delicadamente, pipetando para cima e para baixo, homogeneizando bem a suspensão. ⚠️ IMPORTANTE: O volume de meio de congelamento deve ser calculado para garantir uma concentração final entre 1,5 × 10⁶ e 1,5 × 10⁷ células por alíquota (evitar concentrações abaixo desse valor).
9. Aliquote rapidamente o volume ideal de 1,5 mL da suspensão celular homogeneizada em cada criotubo previamente rotulado (Linhagem, Passagem, Concentração, Data, Responsável).
10. Acomode os criotubos no recipiente de congelamento (“Mr. Frosty”) contendo isopropanol em temperatura ambiente.
11. Transfira imediatamente o Mr. Frosty para o freezer a 🌡️ -80°C.
12. ⏸️ Mantenha no freezer a -80°C por pelo menos ⏳24 h.
13. Após 24h, transfira os criotubos do Mr. Frosty diretamente para as caixas de armazenamento definitivo no tanque de nitrogênio líquido (fase de vapor ou líquida, conforme padronização do laboratório).

• ❄️ Riscos físicos e térmicos: O manuseio de nitrogênio líquido e de racks/caixas de criopreservação exige o uso obrigatório de EPIs específicos: luvas criogênicas, óculos de proteção ampla ou protetor facial (face shield) e jaleco de algodão fechado. Risco severo de queimaduras por frio.
• ☣️ Risco Biológico: Manipule as células seguindo as normas de biossegurança de Nível 2 (NB-2). Todo o manuseio de frascos abertos deve ocorrer obrigatoriamente dentro da cabine de segurança biológica.
• ️🧪 Risco Químico: O DMSO penetra facilmente na pele, carreando consigo outras substâncias potencialmente tóxicas ou patógenos; o uso de luvas é rigorosamente obrigatório.
• 🚮 Descarte biológico: Materiais plásticos descartáveis que entraram em contato com as células ou com DMSO devem ser descartados em sacos brancos leitosos para esterilização em autoclave pré-segregação para incineração. O isopropanol do Mr. Frosty deve ser descartado como resíduo químico perigoso quando perder sua eficácia.

1. O isopropanol presente no Mr. Frosty absorve umidade e perde a capacidade de garantir a taxa de resfriamento correta com o tempo. Recomenda-se a troca do isopropanol a cada 5 ciclos de congelamento.
2. Registre imediatamente a inserção das novas amostras no inventário de células criopreservadas do ViriCan (incluindo posição exata no rack/caixa/canister do tanque).

© ViriCan | Grupo de Estudos em Carcinogênese Viral e Biologia dos Cânceres, UNESP. Botucatu, São Paulo, Brasil. info@virican.net