Cadastrar oligonucleotídeos (iniciadores, sondas, etc.) sintetizados em empresas especializadas e recebidos para uso nas atividades de biologia molecular do ViriCan, bem como proceder com a correta ressuspensão das matrizes liofilizadas e preparação de alíquotas de uso.

O rigoroso registro e rastreabilidade de oligonucleotídeos são etapas críticas de boas práticas de laboratório (BPL). Eles garantem a reprodutibilidade dos ensaios moleculares, evitam a redundância na compra de reagentes e mantêm um histórico confiável de sequências, fabricantes e lotes. A padronização de nomenclatura de oligonucleotídeos por meio de um código identificador único (ID) simplifica a rotulagem em microtubos (onde o espaço é restrito) e facilita a referência cruzada exata nos cadernos de laboratório. Após o registro, a ressuspensão em tampão apropriado (TE) e a confecção de múltiplas alíquotas de uso (10 µM) a partir de uma matriz ultraconcentrada (1 mM) preservam a estabilidade do iniciador, mitigando danos por repetidos ciclos de congelamento e descongelamento.

Locais de execução do procedimento no IBTEC, UNESP:

• Laboratório Central (Setor J) ou Sala de Estudos (Setor I): Para o registro documental e digital.
• Sala de preparação de mix de pCR (Setor E): Para a ressuspensão asséptica dos oligonucleotídeos liofilizados.

• Microcomputador desktop ou laptop com acesso à Internet.
• Cabine de PCR com lâmpada UV (Setor E).
• Microcentrífuga de bancada e agitador tipo Vortex (Setor E).
• Micropipetas de precisão (10 e 200 µL) dedicadas para preparação de mix de PCR (Setor E)

A organização do banco de oligonucleotídeos do grupo é baseada na identificação com um código serial (ID) padronizado no seguinte formato: “P” + AnoMêsDia + Discriminador.

• O “discriminador” é uma letra maiúscula atribuída conforme a posição do oligonucleotídeo no lote sintetizado: “A” para o primeiro, “B” para o segundo, “C” para o terceiro, e assim por diante.
• ℹ️ Exemplo: O primeiro oligonucleotídeo do lote sintetizado em 22/Mar/2012 deve ser denominado P20120322A; o segundo como P20120322B, etc.
• O código ID deve ser usado obrigatoriamente em todos os registros experimentais, juntamente com o nome real da sequência. ℹ️ Exemplos de anotação no caderno: Primer P20120302A = HIV1Tat(nt8044).A ou Primer P20120302B = HIV1Tat(nt8044).S.
• 🚨 CRÍTICO: O código serial deve ser registrado na tampa e na lateral dos tubos das matrizes originais!

⚠️ ATENÇÃO: Todos os oligonucleotídeos sintetizados devem ser registrados o mais rapidamente possível após recebimento. Tenha em mãos as planilhas/certificados de análise fornecidos pela empresa.

A. Registro Físico

1. Obtenha a pasta-arquivo e o livro-ata de oligonucleotídeos do grupo.
2. No livro-ata, no espaço reservado para cada oligonucleotídeo (uma linha por item), anote: Código interno (ID), Data do lote, Nome do oligonucleotídeo e Suas iniciais.
3. Sempre que a empresa fornecer etiquetas adesivas extras, cole-as no livro-ata à esquerda das informações registradas.
4. Perfure e anexe o certificado de análise em papel na pasta-arquivo, respeitando a ordem cronológica inversa (o documento mais recente fica no topo).

B. Registro Digital

1. No microcomputador, acesse o formulário online em https://virican.net/lnk/olgntd.
2. Preencha as informações solicitadas no banco de dados. ℹ️ Nota: Verifique as planilhas de análise do fabricante para preencher:
   • Solicitante
   • Número do pedido
   • Data de síntese
   • Empresa fornecedora
   • Lote
   • Nome do oligonucleotídeo
   • Número de referência do fabricante
   • Código ID ViriCan
   • Quantidade em OD260
   • Massa total (convertida em µg)
   • Quantidade em nmoles
   • Sequência nucleotídica
   • Local de armazenamento.
3. Digitalize (scanner/foto) e encaminhe para gerlab@virican.net antes de arquivá-lo na pasta física.

1. Prepare o ambiente para preparação dos oligonucleotídeos (Setor E) limpando a superfície da área de trabalho com etanol 70%
2. Acione o tratamento com luz UV por ⏳ 15 min.
3. 🚨 CRÍTICO: Centrifugue os tubos contendo os oligonucleotídeos liofilizados antes de abri-los para evitar perda de material.
4. Para o preparo da matriz, localize a quantidade exata em nmoles descrita para cada oligonucleotídeo.
5. Adicione um volume de solução TE perfeitamente igual à quantidade em nmoles.
6. Anote na tampa e na lateral do tubo a concentração final da matriz obtida (1 nmol/µL ou 1 mM).
7. Agite bem com o auxílio do vortex e incube por pelo menos ⏳ 30 min em temperatura ambiente.

ℹ️ Regra geral: Prepare 4 alíquotas com 125 µL cada para cada iniciador, em microtubos de 0,5 mL.

1. No tubo designado para a alíquota 1/4, acrescente 495 µL de solução TE e 5 µL da matriz a 1 mM.
2. Agite a mistura e distribua volumes iguais de 125 µL para os tubos das alíquotas 2/4, 3/4 e 4/4.
3. ⚠️ ATENÇÃO: É estritamente obrigatório identificar os tubos das alíquotas com as seguintes informações:
   • Tampa do tubo: Código serial do oligonucleotídeo, número da alíquota (ex: 1/4, 2/4, 3/4, 4/4) e a concentração de uso (10 µM).
   • Lateral do tubo: Código serial, número da alíquota e o lote de síntese (no formato AnoMêsDia).
4. ⏸️ Armazene a alíquota de uso imediato a 🌡️ -20°C.
5. Armazene as alíquotas reservas (2/4, 3/4 e 4/4) e os tubos de matrizes puras a 🌡️ -80°C (freezer ULT).

• 🔒 Segurança da Informação: O banco de dados digital de sequências é o coração operacional do laboratório. Certifique-se de não sobrescrever acidentalmente IDs antigos e verifique se as sequências foram digitadas corretamente para evitar falhas experimentais.
• ☀️ Riscos físicos: A irradiação com luz UV causa queimaduras na pele e danos oculares graves. Nunca permaneça no ambiente durante a esterilização por UV.

Nada a destacar

© ViriCan | Grupo de Estudos em Carcinogênese Viral e Biologia dos Cânceres, UNESP. Botucatu, São Paulo, Brasil. info@virican.net